TEM des bactéries à capsules

  1. Obtenir une culture permettant de générer un culot de 200 µl.
  2. Centrifuger à 2000 g durant 5 minutes
  3. Agiter durant toutes les étapes jusqu'à l'inclusion
  4. Laver 2x dans le tampon phosphate salin (PBS) 10 mM pH 7.3
  5. Fixer 2.5h avec :
    • glutaraldehyde (GA) 3%
    • rouge de ruthénium (RR) 0.15%
    • tampon cacodylate 0.1M pH 7.0
  6. Préparer l'agar 3% à 42°C
  7. Préparer une solution de lavage de 80 ml / échantillon :
    • rouge de ruthenium (RR) 0.05%
    • tampon cacodylate 0.1M pH 7.0
  8. Laver 2x
  9. Traiter avec 500 µl de ferritine pour 30 min :
    • Ferritine 1 mg/ml final
    • Cacodylate 0.1M
  10. Arrêter la réaction en ajoutant 5 ml solution de lavage
  11. Laver 3x
  12. Resuspendre dans l’agar 3% à 42°C
  13. Laver 5x
  14. Post-fixer dans OsO4 1% + RR 0.05% pour 1.5h
    • 1 ml OsO4 4%
    • 2 ml RR 0.10% + cacodylate 0.2M
    • 1 ml H2O
  15. Laver 5x
  16. Déshydrater dans l’ethanol :
    1. 30%, 50%, 70% (+ RR 0.05%, 10 min)
    2. 95%, 100% (sans RR, 10 min)
    3. 100% 40 min, 100% 10 min (sans RR)
  17. Déshydrater dans l’oxyde de propylène (OP) 2x 15 min
  18. Ajouter 1:2 de résine Spurr1) à l'OP restant et bien mélanger, pour 2.5h
  19. Infiltrer dans 1:1 de Spurr et OP pour la nuit
  20. Infiltrer dans 3:1 de Spurr et OP pour 2.5h
  21. Infiltrer dans 100% de Spurr + DMAE pour la nuit
  22. Inclure en blocs et polymériser la nuit à 60°C
1)
Voir protocole pour la résine Spurr