TEM des bactéries à capsules

Obtenir une culture permettant de générer un culot de 200 µl.
Centrifuger à 2000 g durant 5 minutes
Agiter durant toutes les étapes jusqu'à l'inclusion
Laver 2x dans le tampon phosphate salin (PBS) 10 mM pH 7.3
Fixer 2.5h avec :
- glutaraldehyde (GA) 3%
- rouge de ruthénium (RR) 0.15%
- tampon cacodylate 0.1M pH 7.0
Préparer l'agar 3% à 42°C
Préparer une solution de lavage de 80 ml / échantillon :
- rouge de ruthenium (RR) 0.05%
- tampon cacodylate 0.1M pH 7.0
Laver 2x
Traiter avec 500 µl de ferritine pour 30 min :
- Ferritine 1 mg/ml final
- Cacodylate 0.1M
Arrêter la réaction en ajoutant 5 ml solution de lavage
Laver 3x
Resuspendre dans l’agar 3% à 42°C
Laver 5x
Post-fixer dans OsO4 1% + RR 0.05% pour 1.5h
- 1 ml OsO4 4%
- 2 ml RR 0.10% + cacodylate 0.2M
- 1 ml H2O
Laver 5x
Déshydrater dans l’ethanol :
1. 30%, 50%, 70% (+ RR 0.05%, 10 min)
2. 95%, 100% (sans RR, 10 min)
3. 100% 40 min, 100% 10 min (sans RR)
Déshydrater dans l’oxyde de propylène (OP) 2x 15 min
Ajouter 1:2 de résine Spurr¹⁾ à l'OP restant et bien mélanger, pour 2.5h
Infiltrer dans 1:1 de Spurr et OP pour la nuit
Infiltrer dans 3:1 de Spurr et OP pour 2.5h
Infiltrer dans 100% de Spurr + DMAE pour la nuit
Inclure en blocs et polymériser la nuit à 60°C

¹⁾

Voir protocole pour la résine Spurr